副溶血性弧菌噬菌体的分离及初步应用

论文摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为一种重要的食源性的致病细菌,可通过污染的食品进行传播,可导致人类急性肠胃炎等临床症状。V.parahaemolyticus可以在食品和食品加工生产线的接触表面形成菌膜,从而大幅增加了该菌的净化、清理以及防控的难度。另外,水产品养殖环节会大量使用抗生素控制致病细菌,以期降低生产和销售损失,但是抗生素的滥用导致致病细菌耐药性增加,且造成了环境污染。探求一种行之有效且环保地控制V.parahaemolyticus污染的体系是亟待解决的关键问题。烈性噬菌体是一种特异性裂解宿主细菌细胞的病毒,具有极高的宿主特异性、强裂解活性以及安全无污染的特点,使其广泛地应用于致病性细菌的生物治疗当中。因此,V.parahaemolyticus特异性噬菌体分离鉴定、生理生化特性分析成为有效防控该菌的前提。为了完成上述目标,本研究开展了如下的工作:（1）副溶血性弧菌烈性噬菌体的分离与鉴定。本研究于2016年9月至2017年10月间,每两周从上海市及周边采集地表水样品,共计130份,其中包括上海市两大农产品交易市场的海产品饲养水、上海市区水域沿岸、上海市周边水系、杭州湾和长江入海口水样等。以V.parahaemolyticus标准菌株ATCC 17802为宿主菌,采用双层琼脂平板法从地表水样品中分离纯化得到34株V.parahaemolyticus烈性噬菌体,依次命名为φV01-φV34。利用固体增殖法,将分离毒株效价提高至109 PFU mL-1以上并进行保存。制备透射电镜样品送检,结果显示:所有噬菌体分离毒株均属于有尾噬菌体目;其中,短尾噬菌体科28株（82.35%）、长尾噬菌体科4株（11.76%）和肌尾噬菌体科2株（5.88%）。（2）噬菌体宿主裂解谱的测定及三株代表性噬菌体生理生化特性的分析。挑选能够耐受一种以上抗生素的25株V.parahaemolyticus分离菌株,利用ERIC-PCR方法进行细菌遗传多样性分析。结果显示:在相似度设置为85%时,25株V.parahaemolyticus分离株可被分为17个ER型。以上述不同基因型V.parahaemolyticus菌株为对象,评估34株V.parahaemolyticus烈性噬菌体的裂解谱。根据透射电镜结果,从三种表型噬菌体中各挑选一株裂解谱最广的噬菌体作为代表（φV05、φV07、φV09）进行后续的生理生化特性分析。噬菌体基因组酶切结果显示:所选三株噬菌体酶切图谱差异较大,进一步证实了三种表型噬菌体个体的差异。对上述三株噬菌体生理生化特性的分析结果表明:噬菌体代表毒株保持活性的最佳环境温度、pH和盐度范围分别为25℃50℃、2.012.0和1.5%5.0%。一步生长曲线结果表明:三株噬菌体感染宿主菌的潜伏期短（15 min）,裂解量为458593。（3）副溶血性弧菌噬菌体的初步应用。对筛选出的三株代表性噬菌体及噬菌体混合鸡尾酒分别进行了针对抑制菌膜形成和已成菌膜消除能力的评估。结果表明:单一噬菌体及噬菌体混合物均能够有效防止V.parahaemolyticus菌膜的形成,但不能破坏已形成的菌膜。另外,本研究将噬菌体φV09用于V.parahaemolyticus人工污染牡蛎模型的净化。研究结果表明:所分离噬菌体对牡蛎体内人工污染的V.parahaemolyticus具有较好的净化作用;作用48 h即可将人工养殖牡蛎水体环境中的V.parahaemolyticus浓度由1.0×106 CFU mL-1降低至3.6×103 CFU mL-1;牡蛎体内V.parahaemolyticus的浓度降至5.7×102 CFU mL-1,而对照组细菌浓度高达7.9×104 CFU mL-1。综上所述,本研究成功分离得到34株V.parahaemolyticus烈性噬菌体;三株噬菌体代表毒株裂解谱广,裂解能力强,对环境因素的耐受能力强;可有效抑制V.parahaemolyticus菌膜的形成;对牡蛎体内V.parahaemolyticus的净化具有显著效果,为食源性致病细菌防控提供了理论支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 副溶血性弧菌概述
•     1.1.1 副溶血性弧菌的生理特性
•     1.1.2 副溶血性弧菌的主要毒力因子
•     1.1.3 副溶血性弧菌的流行病学特征及血清分型
•     1.1.4 副溶血性弧菌的菌膜
•     1.1.5 副溶血性弧菌对我国水产养殖行业的影响
•   1.2 弧菌病的传统防治方法
•   1.3 噬菌体概述
•     1.3.1 噬菌体研究和噬菌体治疗的历史
•     1.3.2 噬菌体的分类与形态特征
•     1.3.3 噬菌体的感染与增殖
•     1.3.4 噬菌体的应用概况与发展趋势
•     1.3.5 噬菌体治疗优势和劣势
•   1.4 研究目的和意义
•   1.5 研究内容
• 第二章 副溶血性弧菌噬菌体的分离纯化及鉴定
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株与地表水样品
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 设备与仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 样品采集
•     2.2.2 副溶血性弧菌噬菌体的分离及纯化
•     2.2.3 副溶血性弧菌噬菌体的增殖及效价测定
•     2.2.4 副溶血性弧菌噬菌体的保存
•     2.2.5 副溶血性弧菌噬菌体的电镜观察
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 噬菌体的分离纯化
•     2.3.2 噬菌体的效价测定
•     2.3.3 噬菌体的电镜观察结果
•   2.4 本章小结
• 第三章 副溶血性弧菌噬菌体生理生化特性的研究
•   3.1 材料
•     3.1.1 实验菌株与噬菌体
•     3.1.2 培养基
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 设备与仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 菌株活化
•     3.2.2 Enterobacterialrepetitiveintergenicconsensuspolymerasechain reaction（ERIC-PCR）
•     3.2.3 副溶血性弧菌噬菌体宿主裂解谱的测定
•     3.2.4 三株代表性噬菌体基因组的提取及酶切鉴定
•     3.2.5 三株代表性噬菌体一步生长曲线的测定
•     3.2.6 三株代表性噬菌体生理生化特性的测定
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 ERIC-PCR分析结果
•     3.3.2 副溶血性弧菌噬菌体宿主裂解谱
•     3.3.3 副溶血性弧菌噬菌体基因组酶切结果
•     3.3.4 三株代表性噬菌体的一步生长曲线
•     3.3.5 三株代表性噬菌体的生理生化特性
•   3.4 本章小结
• 第四章 副溶血性弧菌噬菌体的初步应用
•   4.1 材料
•     4.1.1 实验菌株
•     4.1.2 培养基
•     4.1.3 主要试剂
•     4.1.4 设备与仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 噬菌体混合鸡尾酒的制备
•     4.2.2 噬菌体对菌膜形成能力的评价
•     4.2.3 噬菌体对形成菌膜消除能力的评价
•     4.2.4 噬菌体在牡蛎净化中的初步应用
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 噬菌体对菌膜形成能力的抑制
•     4.3.2 噬菌体对形成菌膜的消除作用
•     4.3.3 牡蛎养殖环境中副溶血性弧菌数量的变化
•     4.3.4 牡蛎体内副溶血性弧菌的浓度监测
•   4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 殷玉洁

导师: 王大鹏

关键词: 副溶血性弧菌,噬菌体,菌膜,水产,牡蛎

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海交通大学

基金: “十三五”重点研发计划(2016YFE0132000)和(2017YFF0210200)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.003287

总页数: 73

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